Durante la mañana del 25 de mayo, una gran multitud comenzó a reunirse en la plaza de la Victoria, actual plaza de Mayo, liderados por los milicianos de Domingo French y Antonio Beruti. Se reclamaba la anulación de la resolución del día anterior, la renuncia definitiva del virrey Cisneros y la formación de otra Junta de gobierno.
La multitud invadió la sala capitular, reclamando la renuncia del virrey y la anulación de la resolución tomada el día anterior.
El Cabildo se reunió a las nueve de la mañana y reclamó que la agitación popular fuese reprimida por la fuerza. Con este fin se convocó a los principales comandantes, pero éstos no obedecieron las órdenes impartidas. Los que sí lo hicieron afirmaron que no solo no podrían sostener al gobierno, sino tampoco a sus tropas, y que en caso de intentar reprimir las manifestaciones serían desobedecidas por estas.
Cisneros seguía resistiéndose a renunciar, y tras mucho esfuerzo los capitulares lograron que ratificase y formalizase los términos de su renuncia, abandonando pretensiones de mantenerse en el gobierno. Esto, sin embargo, resultó insuficiente, y representantes de la multitud reunida en la plaza reclamaron que el pueblo reasumiera la autoridad delegada en el Cabildo Abierto del día 22, exigiendo la formación de una Junta. Además, se disponía el envío de una expedición de quinientos hombres para auxiliar a las provincias interiores.